我们设计的试验方案是使用电转仪进行电击转化,将质粒导入毕赤酵母中。后面我们将转化后的酵母涂板在YPD平板上,筛选出转化成功的菌落。然后再进一步将筛选出来的菌落进行PCR验证,验证没有问题我们在送去杭州有康生物科技有限公司进行测序分析。后面要做的工作就是将最终验证无误的菌株进行尝试诱导表达了。每一步的实验方案设计都是从文献里面查找的,进行也是很不容易,总是在一步步的试错中,但其实科研不就是这样嘛,从实验设计开始,一步步验证推进,试错,再反过来完善方案。
【电转】
1、处理电转杯:将电转杯电极狭缝对准超净台紫外灯,杯盖朝上,紫外照射消毒。
1、将制备好的感受态细胞80μl与5-10μg线性化DNA(在5-10μl无菌水中)混合,并将它们转移到2mm的冰镇电穿孔反应杯中;
注:对于环状DNA,使用50–100μg;
2、将试管与细胞在冰上孵育5分钟;
3、擦干电转杯,电击条件:电压2kV,电阻200Ω,电容25μF,电击时间为4-20msec,杯子2mm;
4、立即向反应杯中加入1ml 1M预冷山梨醇。将反应杯内容物移入无菌的1.5ml试管中,在30℃下静置培养1小时;
5、取100μl分别涂在含有100μg/ml Zeocin™的YPDS板上。
6、在30°C下避光培养直到形成菌落。
7、选取10-20个菌落,在含有100μg/ml Zeocin™的新鲜YPDS平板上纯化(单个菌落为条纹状)。
【菌液PCR验证】
1、将1ml过夜培养物的菌体沉淀用1ml无菌水重悬,然后100℃,金属浴10min;
2、迅速转入-80℃冰箱冻存10min;
3、从冰箱取出后再次100℃,金属浴10min;
4、重复煮沸-冷冻-煮沸3-4次后收集上清,进行PCR鉴定;
5、1%琼脂糖凝胶检测
点赞 (0)
回复