三周过去了，南京金斯瑞合成的四个重组质粒都到了，公司给的一般有一管质粒粉末和一管菌种，这管菌种里已经导入了我们的重组质粒。我需要做的第一步就是先把这个菌种先保存好，以免后期没有了原始菌种。我们的目的是把这个重组质粒导入的毕赤酵母中，所以第一步我们需要从这个菌种中提取我们的重组质粒，使用限制性内切酶对质粒进行单酶切，只有将质粒单酶切之后才能将其带入到毕赤酵母中。然后需要制备毕赤酵母的感受态。
附：
【质粒提取】
1.取2个1.5ml EP管，菌液倒满EP管。
2.EP管11000 x g离心1分钟，弃上清。
3.加200ul FAPD1 Buffer到EP管中，重悬菌液。
4.加入200ul FAPD2 Buffer，翻转5次，室温静置3分钟。
5.加300ul FAPD3 Buffer，翻转5次。
6.放入离心机，11000 x g离心5分钟，将吸附柱放入收集管中。
7.将液体转移到吸附柱，11000 x g离心30秒，弃掉流液。
8.加400ul W1 Buffer到吸附柱中，离心机11000 x g离心30秒，弃流液。
9.加700ul的Wash Buffer到吸附柱，离心机11000 x g离心30秒，弃流液。
10.各放入一个新1.5ml EP管11000 x g，离心3分钟，空转。
11.放入新EP管加50ul灭菌蒸馏水到吸附柱膜中央，静置1分钟。
12.离心机11000 x g，离心1min，测取质粒浓度，质粒放-20℃保存。
【酶切及割胶回收】
1.取两个200ulEP管。
2.分别加入酶切反应试剂。
3.37℃培养箱放置4h。
4.酶切产物进行跑核酸胶及割胶，放入两个已称重的1.5mlEP管中，测出胶的质量。
5.两管胶的质量都为300mg，分别向EP管中加入500ul的FADF Buffer，金属浴55℃加热10min至胶状物热熔，期间每2-3min翻转EP管。
6.冷却，取两个吸附柱分别放入收集管。吸取800ul热熔物到吸附柱，11000 x g离心30秒，弃流液。
7.分别加750ulWash Buffer到吸附柱，11000 x g离心30秒，弃流液。
8.11000 x g离心3min。取两个的1.5mlEP管，将吸附柱放入其中，加50ul的ddH2O静置1min。
9.11000 x g离心1min，收集DNA，跑胶检验产物。-20℃冰箱保存。
【感受态制备】
1、取GS115冻存菌，无抗YPD平板划线，倒置于28℃-30℃培养箱中培养2-3天；
2、挑取单菌落接种于含有5ml的无抗BMGY培养基中培养皿中，30℃，250rpm过夜；
3、将步骤2中的GS115菌液30-50μl 接种于含50ml BMGY液体培养基的250ml锥形瓶中，30℃，220rpm过夜培养至OD600= 1.3-1.5；
4、将细胞在1500×g的温度下在4℃下离心5分钟。用50ml预冷的无菌水将颗粒再悬浮。
5、按照第3步离心分离细胞，然后用25ml预冷的无菌水重新悬浮颗粒。6、如步骤3所述，离心分离细胞，然后将细胞重悬于2ml 1M预冷山梨醇中。
7、按照第3步离心分离细胞，然后将细胞重悬于100μl预冷的1M山梨醇中，保持细胞在冰上，并在当天使用。（用10%-15%甘油1M无菌山梨醇溶液重悬菌体，分装保存-80℃备用）